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中科起源白芨植物组织培养的快速繁殖体
白芨为兰科白芨属多年生草本植物白芨的干燥块茎，具有收敛止血，消肿生肌，清热利湿的功效，用于治疗咯血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等症状。随着现代药理学研究的不断深入，发现白芨对结核杆菌、炎症细胞等有明显的抑制作用，白芨的市场需求也日益扩大。与其他兰科植物一样，白芨虽然有数以万计的种子，但是这些种子是发育不完全的没有胚乳的种子，在自然界中很难萌发和生长。
目前市场上白芨人工栽培主要依靠分株繁殖，这种方式不仅周期长，技术不成熟，而且由于缺乏优良品种，很难满足白芨的市场需求。因此保护白芨野生资源，解决白芨的资源问题已成为当务之急。本研究利用植物组织培养技术，采用液体悬浮培养的方式进行快繁实验研究，并在此基础上通过愈伤组织诱导及再分化的方式，实现白芨组培苗的快速大量繁殖，液体悬浮培养已经在铁皮石斛原球茎培养中获得成功，但是在白芨种子的培养上还鲜有报道。如若能成功实现，将为白芨市场化需求提供新的技术支持。
材料及试剂.实验材料成熟未开裂白芨蒴果。
.实验试剂本实验采用的MS培养基中维生素及肌醇为美国进口分装，大量元素、钙盐及微量元素，FeSO4·7HO，NaEDTA，6-苄氨基嘌呤（6-BA）、6-糠氨基嘌呤（KT），，4-二氯苯氧乙酸（,4-D），-萘乙酸（NAA）为美国进口分装。所有试剂的纯度为分析纯级。
.实验主要仪器设备LDZX-75KBS立式压力灭菌锅，超净工作台，AR0电子精密天平，OhausCorp.PincBrook，NJ，USA；自动双重纯水蒸馏器。
北京中科起源科技有限公司可提供以上所有药剂设备。
方法步骤.消毒灭菌..不同方式对白芨果荚进行消毒白芨成熟果荚用自来水洗去表面尘土后用洗衣粉彻底浸泡0min，自来水冲洗0min，彻底洗净。超净台内，采用75%酒精浸泡min、0.%HgCl浸泡5min、75%酒精浸泡min后再用0.%HgCl浸泡5min、对照组不处理等4种方式对白芨果荚进行消毒，每种消毒方式次消毒颗种子，每种方式各消毒0次。用无菌水洗净果荚后用洁净的剪刀镊子剪开，将种子播种到不含琼脂的/MS培养基中萌发，5d后统计污染率。
..实验外植体准备将未污染的白芨种子用0.09%的琼脂水混悬，形成0.g(FW)·mL-的种子悬液，备用。取无菌白芨组培苗，用洁净的剪刀和镊子将叶片剪成0.5cm×0.5cm大小的小块，将茎段剪成0.5cm长短的小段，将根尖部分剪下，备用。
.白芨液体培养快速繁殖..白芨生长最佳液体培养基的筛选取mL种子悬液于表各组液体培养基中培养，筛选白芨生长最佳液体培养基，每组5个重复，转接后第0、0、0d统计其原球茎生长状况，相同数目下，重量越重说明原球茎个体越大，生长状态越好。
..白芨原球茎在不同光照时长环境中培养取mL种子悬液接种于8mL上述最佳液体培养基中，光照时长分别设置为0h·d-，6h·d-，h·d-，4h·d-，每组5个重复，接种后第0、0、0d统计其原球茎生长状况，相同数目下，重量越重说明原球茎个体越大，生长状态越好。
..白芨原球茎在不同pH值的培养基中培养植物组织培养过程中，常用的pH值为5～6之间，一般不使用较高或较低的pH值，因此将上述最佳液体培养基的pH分别调节至5.、5.8、6.5、7.0、7.5，取种子悬液5mL接种于95mL液体培养基中，每组5个重复，接种后第0、0、0d统计其原球茎生长状况，相同数目下，重量越重说明原球茎个体越大，生长状态越好。
.愈伤组织诱导及再生..愈伤组织诱导以白芨种子、叶片、茎段和根尖为外植体，分别接种到表所示的培养基中。每个组培瓶中接种0个（块）外植体，每组0个重复，0d后观察外植体伤口处是否出现嫩绿色或乳白色无序细胞团，即愈伤组织，统计出现愈伤组织的外植体数目，计算愈伤组织诱导率并分析。
..愈伤组织抗褐化及增殖将等大小的新鲜愈伤组织块接种到添加了0.g·L-、0.5g·L-、0.7g·L-、.0g·L-活性炭(AC)，0.05g·L-、0.g·L-、0.5g·L-、.0g·L-聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，mg·L-、5mg·L-、0mg·L-、5mg·L-抗坏血酸(VC)的MS+.5mg·L-，4-D+.0mg·L-6-BA的培养基中（组合方案见表5），以MS培养基为对照组，通过对愈伤组织褐化程度、生长状态及增重量的比较，探索白芨愈伤组织增殖及抗褐化的最佳方案。
..愈伤组织再分化将愈伤组织接种到表5所示的培养基中。每种培养基0管，每管接种个新鲜愈伤组织，0d后，随机抽取5管，统计愈伤组织再分化形成丛生芽的数目，计算分化率并分析数据。
..4丛生芽生根将cm左右的丛生芽转接到含有表5所示培养基中进行生根培养。每种培养基0管，每管接种棵白芨苗，0d后随机抽取5管，统计丛生芽新生根的数目，计算生根率并分析。
..5有机添加物对白芨组培苗球茎生长的影响将白芨组培苗移栽到添加了0%香蕉汁、0%土豆汁及不添加有机物的MS+.0mg·L-6-BA+0.5mg·L-NAA培养基中。每种培养基6瓶，每瓶接种5棵白芨苗，0d后随机抽取0瓶，观察球茎大小。
.4数据统计愈伤诱导率=（出现愈伤组织的外植体数/外植体总数）×00%；分化率=（分化出芽的愈伤组织块数目/接种的愈伤组织块数目）×00%；生根率=（有根形成的植株数/接种的植株数）×00%。实验结果采用DPS分析软件进行数据处理及分析，P0.05表示差异具有统计学意义。
实验结果.不同消毒方式对白芨污染率的影响不同消毒方式对白芨污染情况结果如表所示，对照组未做处理的果荚全部污染，经过75%酒精处理min或者0.%HgCl处理5min都可以在一定程度上起到消毒作用，75%酒精处理min后再用0.%HgCl处理5min的消毒方式则可以使污染率控制在5%以下，起到最佳的消毒效果。
.白芨液体培养快速繁殖..不同培养基对白芨生长的影响不同培养基对白芨原球茎生长的影响实验结果见图。、5、9号培养基表现出了明显的增重趋势，其中9号培养基中的白芨原球茎重量最大，长势最优，即MS为白芨液体悬浮培养的最优培养基。
..不同光照时长对白芨原球茎生长的影响不同光照时长对白芨原球茎生长的影响实验结果见图，在第0d时，四个光照时长的白芨原球茎重量差异不大，第0d和第0d时，白芨原球茎在光照时长4h·d-时生长量达到最大值，此时重量最大，原球茎生长状态最佳。其中，“h·d-”“4h·d-”这两个水平的白芨原球茎生长量无统计学意义（P＞0.05）。因此，白芨悬浮培养最适宜的光照时间为～4h·d-。
..不同pH对白芨原球茎生长的影响不同pH对白芨原球茎生长的影响实验结果见图。在接种后第0d，各组白芨原球茎重量都未表现出差异，接种后第0d，pH为6.5时，白芨原球茎生长量达到最大，此时重量最大，原球茎生长状态最佳。接种后第0d，pH为5.8时，白芨原球茎生长量达到最大，此时重量最大，原球茎生长状态最佳。因此，白芨适宜生长的pH为5.8～6.5。
.白芨愈伤组织诱导及再生体系结果..愈伤组织诱导结果白芨诱导愈伤组织的诱导率结果见表4，诱导愈伤组织最佳外植体为种子，最佳培养基组合为：MS+.5mg·L-，4-D+.0mg·L-6-BA。在此培养基中种子诱导率最高，几乎可达00%，组织块个体较大、均一，且无褐化及再分化现象。
..愈伤组织抗褐化及增殖结果将愈伤组织块接种到抗褐化及增殖培养基中，实验结果如表5所示。在培养基MS+.5mg·L-，4-D+.0mg·L-6-BA+5mg·L-抗坏血酸中，愈伤组织块增重最多，质地疏松，色泽嫩绿，无分化现象，无褐化现象，抗褐化及增殖效果最理想，为白芨愈伤组织最佳抗褐化及增殖培养基。
..愈伤组织再分化结果将愈伤组织接种到分化培养基中，经过60d培养，结果如表6所示。在培养基MS+0.mg·L-NAA+0.5mg·L-6-BA中，愈伤组织分化率最高，分化的芽数也最多，分化的丛生芽最高，为愈伤组织分化最佳培养基。
..4丛生芽生根结果将白芨无根苗进行生根诱导培养，0d统计在不同培养基中白芨苗的生根率，结果见表6。白芨无根苗在MS+0.8mg·L-NAA+.0mg·L-6-BA上显著性最好，生根率最高，根数目最多，为白芨生根最佳培养基。
..5有机添加物影响结果将白芨组培苗接种到添加了有机物的MS+.0mg·L-6-BA+0.5mg·L-NAA培养基中，结果如图4，香蕉汁与土豆汁对白芨球茎的生长都有促进作用，添加了香蕉汁的培养基中的白芨球茎比土豆汁中的更大，根系也较为发达，因此本实验认为MS+.0mg·L-6-BA+0.5mg·L-NAA+0%香蕉汁的培养基为白芨球茎生长最佳培养基。
4讨论在白芨液体培养快速繁殖体系中，激素的种类和浓度配比在胚萌发初期起到了一定的促进作用，但在0d，未加激素的基础培养基中的白芨原球茎长势最好，添加了激素的培养基中的白芨苗，出现了不同程度的玻璃化现象，抑制了白芨的生长，所以本研究认为最佳的白芨液体快速繁殖培养基为MS基础培养基。
在MS培养基的基础上我们对影响白芨生长中的一些因素进行了考察，结果表明：在不同光照时长对白芨原球茎生长影响大，随着光照时间的延长，白芨原球茎生长量也随着增长，当光照时间不足时白芨原球茎出现白化现象，甚至死亡。本研究中，当光照时间达到h以上时，白芨原球茎的生长较为旺盛，因此在实际应用时可以采用h光照时长。此外，还考察了pH值对白芨生长的影响，白芨生长最佳pH为5.8～6.5。本研究初步建立了白芨液体快速繁殖体系，通过液体培养的方式，能够实现白芨原球茎的快速大量繁殖，但仍存在一定缺陷，需要在以后的研究中进一步完善。
在愈伤组织诱导过程中，采用的，4-D是植物组培常用合成植物生长素，，4-D可以在植物体内累积，达到一定浓度时，使植物体内激素失衡，改变器官的生长状态。本实验中，，4-D的浓度达.5mg·L-时，能有效的诱导愈伤组织，但超过.0mg·L-时，出现严重的褐化现象。在培养基中添加5mg·L-的抗坏血酸，不仅可以有效抑制褐化现象，而且可以促进愈伤组织的增殖。在愈伤组织分化过程中，低浓度的生长素，有利于愈伤组织的分化形成丛生芽，而提高生长素的浓度，则有利于根的形成。添加有机物香蕉汁，有利于白芨组培苗假鳞茎的生长。
本研究以白芨为材料，通过愈伤组织诱导、增殖，愈伤组织再分化和生根诱导，成功建立了白芨组培快速繁殖体系。最佳诱导愈伤组织培养基组合为：MS+.5mg·L-，4-D+.0mg·L-6-BA，胚状体为外植体时，诱导率可达00%。增殖培养基为MS+.0mg·L-6-BA+.5mg·L-，4-D+5mg·L-抗坏血酸，可以有效的防止褐化现象。分化培养基为MS+0.mg·L-NAA+0.5mg·L-6-BA，分化率可以达到80.00%。生根培养基为MS+0.8mg·L-NAA+.0mg·L-6-BA，生根率可达9.%。有机添加物能够有效的促进白芨假鳞茎的生长，对于根的生长也有良好的效果，因此在组培过程中可以添加适宜浓度的有机物。
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